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Anti-Photoaging Wirksamkeits- und Wirkungsanalyse von Propolis

2023-02-01

Wenn die Haut UV-Licht ausgesetzt ist, löst eine übermäßige intrazelluläre Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS)[1] eine alterungsbedingte Genexpression aus[2], löst eine Entzündungskaskade aus und verringert Elastin und Kollagen[3] , was zu Alterserscheinungen wie schlaffer Haut und Falten führt [4-6]. Die Expression von Genen im Anti-Photoaging-Prozess der Haut ist eigentlich die Co-Expression von Schutzgenen und Schadensgenen. Zu den Schutzgenen gehören hauptsächlich Matrix-Metalloproteinasen (MMPs), Protein-hemmende Gene und Apoptose-hemmende Gene [7,8], und Schadensgene umfassen hauptsächlich mit dem Kollagenabbau verwandte Gene und mit dem Elastinabbau verwandte Gene. Matrix Metalloproteinase-1 (MMP-1) ist der Abbau. Das Hauptenzym von Typ Ⅰ und Typ Ⅲ Kollagen[9], wenn die Hautzellen MMP-1 überexprimieren, wird die Struktur der extrazellulären Matrix der Dermis stark geschädigt[10], insbesondere dieBeeinträchtigt stark die normale Struktur von Kollagenfasern und elastischen Fasern[11], daher ist MMP-1 iEs ist das Hauptenzym, das Alterserscheinungen wie Falten und feine Linien in der Haut verursacht[12]. =/images/img/18.jpg>

Der wichtigste Altersindikator. Die Erhöhung des ROS-Gehalts beschleunigt die Zellapoptose und sogar den Zelltod [13]. Während des Photoalterungsprozesses der Haut kann UV-Strahlung zu einer übermäßigen ROS-Entwicklung in Hautzellen führen, was wiederum verschiedene biologische Wirkungen des Hautgewebes verursacht [14], wie z Expression antioxidativer Enzyme usw. [16]. Daher ist der ROS-Gehalt auch ein wichtiger Index, um den Grad der Lichtalterung zu bewerten.

Propolis ist auch als Purpurgold bekannt, das reich an Flavonoiden ist, die wirksame Antioxidantien haben und können freie Radikale entfernen und die Zellen vor Schäden durch freie Radikale schützenRadikale [17] können Propolis-Flavonoide die Peroxidation freier Radikale und Schädigungen des Gehirngewebes verhindern [18]. Kaffeesäure-Phenylethylester in Propolis hat auch eine starke antioxidative Wirkung [19]. Der Antioxidationsmechanismus von Propolis besteht hauptsächlich darin, den Weg von ROS im Körper direkt oder indirekt zu regulieren, um das Oxidations-Reduktions-Gleichgewicht im Körper zu regulieren, und durch andere Mittel die Aktivität und den Gehalt verschiedener Enzyme zu regulieren [20]. Propolis wurde bisher bestätigt. Es hat verschiedene Funktionen wie Antioxidation, Abfangen freier Radikale und Immunregulierung, aber es gibt nur wenige Forschungsberichte zur Verlangsamung der Lichtalterung der Haut. Diese Studie basiert auf dem oxidativen Schädigungsmodell von UVA-bestrahlten Fibroblasten und analysiert die Wirkung von Propolis auf die ROS-Clearance. Die Wirkung von Propolis auf die Verzögerung der Hautalterung wurde anhand der Wirkung von Propolis auf die Haut bewertetder Hautalterung, die Expression des oxidationsbedingten Gens MMP-1 und der Gehalt an MMP-1, die eine Grundlage für die Entwicklung und Anwendung von Propolis bildeten. bei Lichtalterung der Haut.

1 Materialien und Methoden

1.1 Materialien und Reagenzien

Propolis-Extrakt wird aus Propolis vom Typ Populus (hergestellt in Henan) durch Extraktion und Trocknung mit absolutem Ethanol gewonnen. Es ist ein dunkelbrauner Feststoff mit einem besonderen Aroma und wird in einem Gefrierschrank bei -20 °C gelagert.

Fibroblasten wurden von Guangdong Boxi Biotechnology Co., Ltd. erhalten. über Primär- und Subkultur von Zellen; zuckerarmes DMEM-Medium (Gibco), PBS (Boster), MTT (Sigma), DMSO (Sigma), Neugeborenes Kälberserum (Sijiqing), Primer (TaKaRa), RNA-Extraktionskit (TaKaRa), Reverse Transcription Kit (TaKaRa), Fluoreszenz Farbstoff (TaKaRa), ROS-Nachweisreagenz (Invitrogen), ELISA-Kit (Abcam).

Propolis-Ethanol-Probe: PrOpolis-Konzentration beträgt 5 %, hergestellt durch Auflösen von Propolis-Extrakt in 75 % Ethanol, braun-schwarze Flüssigkeit, gelagert bei Raumtemperatur; Ethylenglykolprobe: Propoliskonzentration beträgt 5 %, hergestellt durch Auflösen von Propolis mit 75 % Polyethylenglykol, braun-schwarze Flüssigkeit, bei Raumtemperatur gelagert.

1.2 Instrumente und Ausrüstung

Analysenwaage (Denver TB-215D), Milli-Q Integral Pure Water/Ultrapure Water Integrated System (Marke Millipore), Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie-Instrument ( Agilent 1200), CO2-Inkubator (Thermo), Ultra-Clean-Bank (Sujing Antai), inverses Mikroskop (Olympus), Mikrooszillator (Qilin Bell), Mikroplatten-Lesegerät (BioTek), PCR-Instrument (Bio-Rad), fluoreszierende quantitative PCR Instrument (Bole), Inkubator (Test), Durchflusszytometer (BECKMAN).

1.3 Chemische Zusammensetzung von Propolis Analyse

Der Propolisextrakt wurde in einer 5 mg·mL-1 Ethanollösung und nach der Filtermembran hergestelltn entfernt wurde, wurde es zur Analyse und Detektion in einen Hochleistungsflüssigkeitschromatographen gegeben, und die Bedingungen waren wie folgt:

Säule: Sepax HP-C18 (150 mm × 4,6 mm, 5 μm); Eluent: Methanol-1 % Essigsäure; Flussrate: 1,0 ml min-1; Detektionswellenlänge: 280 nm; Säulentemperatur: 36 ℃; Injektionsvolumen: 2 μL;

Gradientenelutionsprogramm: 0–25 min, 20 %–40 % Methanol; 25–55 Minuten, 40–55 % Methanol; 55–70 Minuten, 55 % Methanol; 70~85 min, 55%~100% Methanol.

1.4 Nachweis der Zytotoxizität anhand menschlicher Fibroblasten

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Es gibt 2 Proben in diesem Test, 8 Konzentrationsgradienten werden eingestellt und jede Konzentration wird eingestellt. Richten Sie 3 wiederholte Brunnen ein. Gleichzeitig wurden Lösungsmittelkontrollvertiefungen, Nullabgleichsvertiefungen (mit 10 % zuckerarmer DMEM-Serumkulturlösung von neugeborenen Rindern) und Positivkontrollvertiefungen (8 % DMSO) in dem Testsatz durchgeführt. Dieser Test verwendet die MTT-Methode, um die Lebensfähigkeit zu bestimmenErkennung von Zell-IDs und Screening-Zellen Die maximale sichere Konzentration für die Arzneimittelverabreichung. Die spezifischen Verarbeitungsschritte sind wie folgt:

Zellsuspension herstellen, die Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase verarbeiten und in 96-Well-Platten inokulieren. Zwei Arten von Propolislösungen Es wurden Proben mit unterschiedlichen Konzentrationen (0,005 %, 0,01 %, 0,02 %, 0,04 %, 0,08 %, 0,16 %, 0,31 %, 0,63 %) der Testsubstanz hergestellt. Die Dosierung wurde durchgeführt, als der Prozentsatz der Zellplattierung 40 % bis 60 % erreichte. Legen Sie die Platte nach der Verabreichung für die Kultur in einen Inkubator mit 37 °C und 5 % CO2. Die Zellen wurden 24 Stunden lang inkubiert, der Überstand verworfen, MTT-Arbeitslösung zugegeben und bei 37°C im Dunkeln inkubiert. Verwerfen Sie den Überstand nach 4 Stunden, geben Sie 150 µl Dimethylsulfoxid in jede Vertiefung und lesen Sie den D490-nm-Wert mit einem Mikroplatten-Lesegerät ab.

1.5 Anti-Photoaging-Wirkungstest auf Basis menschlicher Fibroblasten

Das Anti-AgingWirkungstest basiert auf dem oxidativen Schädigungsmodell von UVA-bestrahlten Fibroblasten, indem der Prozentsatz der ROS-Hemmung, die oxidationsbedingte MMP-1-Genexpression und der MMP-1-Gehalt analysiert werden, um die Wirksamkeit des zu testenden Wirkstoffs zu bewerten. Das experimentelle Design ist in Tabelle 1 dargestellt.

1.5.1 Nachweis der ROS-Inhibitionsrate Dilatieren Sie die Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase und inokulieren Sie sie einer Platte mit 6 Vertiefungen und 24 Stunden lang in einem Inkubator mit 37 °C und 5 % CO2 kultivieren. Bereiten Sie verschiedene Konzentrationen von Testsubstanzen gemäß dem experimentellen Design in Tabelle 1 vor. Nach 6, als die Zellausplattierungsrate in der Öffnungsplatte etwa 40 % erreichte, wurde die Verabreichung in Gruppen durchgeführt und jede Gruppe wurde mit 3 Duplikatvertiefungen eingerichtet. 24 Stunden lang in einem Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Gemäß der experimentellen Gruppierung wurde die leere Kontrollgruppe direkt dem Nachweis der ROS-Aktivität unterzogen; die restlichen Gruppen wurden mit UVA i bestrahltn einer Dosis von 10 J cm-2. Nach der Bestrahlung wurde sofort ROS-Aktivität nachgewiesen. Nachdem die Zellen mit PBS gewaschen wurden, wurde 1 ml DCFH mit einer Konzentration von 25 &mgr;mol L-1 in jede Vertiefung gegeben. -DA-Sonde in einer Zellkulturbox bei 37°C für 45 min inkubiert; verwerfen Sie das Kulturmedium, das DCFH-DA enthält, waschen Sie es mehrmals mit PBS, versuchen Sie es mit Zellen mit Trypsin, waschen Sie die Zellen einmal mit PBS, fügen Sie eine bestimmte Menge an frischem PBS hinzu und führen Sie die Detektion durch Durchflusszytometrie durch. Fassen Sie die DCFH-DA-Intensität (mittlere Fluoreszenzintensität) jeder Gruppe zusammen und verwenden Sie das T-Test-Verfahren für die statistische Analyse p>

Die Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase wurden verdaut und in Platten mit 6 Vertiefungen inokuliert und in einem Inkubator bei 37°C, 5% CO2 für 24 Stunden kultiviert. Bereiten Sie verschiedene Konzentrationen von Prüfchemikalien gemäß dem experimentellen Design vor (Tabelle 2). Sammeln Sie nach der Kultur. Das Zellkulturmedium wurde für den nächsten Schritt des ELISA-Nachweistests verwendet. FrüherWaschen Sie die Zellen vorsichtig dreimal mit PBS, verwenden Sie RNA isoPlus, um die Zellen zu lysieren, geben Sie 1 ml Lysat in jede Vertiefung, stellen Sie sie für 5 Minuten auf Raumtemperatur, um sie vollständig zu lysieren, übertragen Sie sie in ein 1,5 ml RNase-freies Eppendorf-Röhrchen, extrahieren Sie die RNA und synthetisieren cDNA, Nachweis der Elastin-Genexpression. Die 2-△△Ct-Berechnungsmethode wurde für die Datenverarbeitung verwendet und die T-Test-Methode wurde für die statistische Analyse verwendet. Die mRNA-Amplifikationszeiten der Blindkontrollgruppe wurden normalisiert und die Probengruppe war signifikant höher als die der Blindkontrollgruppe. Geschlecht wird durch * dargestellt, P<0,05 bedeutet signifikanter Unterschied, gekennzeichnet als *, P<0,01 bedeutet extrem signifikanter Unterschied, gekennzeichnet als **.

1.5.3 Nachweis des MMP-1-Gehalts Sammeln Sie das Zellkulturmedium in 1.4.2 in 1,5-ml-EP-Röhrchen für den MMP-1-ELISA-Nachweis. Das gesammelte Kulturmedium wird bei 1000 g zentrifugiert und der Überstand wird gesammelt und aufbewahrtbei -20℃ für MMP-1-Protein-ELISA-Nachweis. Entwerfen Sie 2 parallele Vertiefungen für jede Gruppe von Standardprodukten, entwerfen Sie 3 parallele Vertiefungen für jede Probengruppe.

2 Ergebnisse und Analyse

2.1 HPLC-Analyse von Propolis-Extrakt

Hochleistungsflüssigkeitschromatographie von Propolis-Extrakt Die Messergebnisse werden angezeigt in Abbildung 1. Die fünf Flavonoid-Monomere mit den höchsten Peakhöhen in dem in diesem Test verwendeten Propolisextrakt sind Brepinepin, Pinusin, Brevicin-3-Acetat, Chrysin und Galangin. Im Propolis-Extrakt ist der Gehalt an Pinesin 3,57 %, Pinesin 4,61 %, Brevinin-3-acetat 7,62 %, Chrysin 5,16 % und Galangin 2,07 % p>

2.2 Zytotoxizitätstestergebnisse

2.2.1 MTT-Testergebnisse Acht Dosiskonzentrationen wurden von hoch nach niedrig und die Zytotoxizität angepasst Der Test wurde an menschlichen Fibroblasten durchgeführt. Die Ergebnisse des Zytotoxizitätstests undDer Trend der Zelllebensfähigkeit ist in Abbildung 2 dargestellt.

Die Breakpoint-Konzentration, bei der der relative Zelllebensfähigkeitswert liegt mehr als 90 % wird als maximale sichere Verabreichungskonzentration angenommen. Gemäß den MTT-Testergebnissen ist ersichtlich, dass verglichen mit der Lösungsmittelkontrolle, wenn die Probenkonzentration der Propolis-Ethanol-Lösung 0,08 % beträgt, der relative Zelllebensfähigkeitswert 128,27 % beträgt, keine Zytotoxizität; Wenn die Probenkonzentration der Propolis-Polyethylenglykol-Lösung 0,08 % beträgt, beträgt der relative Zelllebensfähigkeitswert 126,16 %, keine Zytotoxizität.

2.2.2 Morphologisch Erkennungsergebnisse basierend auf MTT-Test5-Konzentrationsionen wurden für die morphologische Erkennung ausgewählt, und die Erkennungsergebnisse sind in Abbildung 3 und Abbildung 4 dargestellt.

Nach den morphologischen Ergebnissen kann es sein gesehen, dass Propolis-Ethanol-Lösung und Propolis-Polyethylenund wenn die Probenkonzentration der Diollösung 0,08 % betrug, war der Umriss der Zellgrenze klar, die Form war regelmäßig, es gab kein offensichtliches Teilchen in der Zelle und es gab keinen signifikanten Unterschied im Zellzustand der Lösungsmittelkontrollgruppe . Daher, gemäß den MTT-Ergebnissen und morphologischen Ergebnissen, die endgültige Bestimmung von Propolis-Ethanol-Lösung und Propolis. Die maximale sichere Verabreichungskonzentration von Polyethylenglykol-Lösungsproben basierend auf menschlichen Fibroblasten beträgt nicht mehr als 0,08 %.

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2.3 Testergebnisse zur Anti-Photoaging-Wirksamkeit

2.3 . 1 Testergebnisse der ROS-Inhibitionsrate Basierend auf dem oxidativen Schädigungsmodell menschlicher Fibroblasten, die durch UVA stimuliert wurden, durch den Test. Die Änderung des ROS-Gehalts wird verwendet, um die antioxidative Aktivität des getesteten Wirkstoffs zu bestimmen. Die Ergebnisse der ROS-Erkennung und der Analyse der ROS-Inhibitionsrate werden angezeigtsiehe Abbildung 5.

Testergebnisse Diese zeigten, dass im Vergleich zur unbestrahlten BC-Gruppe der ROS-Gehalt nach UVA-Bestrahlung signifikant erhöht war ( P < 0,01), was darauf hinweist, dass das oxidative Schadensmodell erfolgreich etabliert wurde; Im Vergleich zur UVA-Bestrahlungsgruppe reduzierte VE in der PC-Gruppe signifikant den ROS-Gehalt (P < 0,01), wenn die Propolis-Ethanol-Lösungsprobe in einer Konzentration von 0,08 % verabreicht wurde, war der ROS-Gehalt extrem signifikant reduziert (P < 0,01), und die ROS-Inhibitionsrate betrug 13,39 %. Wenn die Propolis-Polyethylenglykol-Lösungsprobe in einer Konzentration von 0,08 % verabreicht wurde, war der ROS-Gehalt signifikant reduziert (P < 0,05) und die Hemmrate betrug 11 %, was darauf hindeutet, dass die Probe die Wirkung hatte, ROS zu fangen und Antioxidation zu erreichen .

Verglichen mit der leeren Kontroll-BC-Gruppe, nach der negativen Kontroll-NC-Gruppe behandelt worden warbei UVA, MMP-1 waren das Expressionsniveau und der MMP-1-Gehalt signifikant erhöht (P < 0,01), was anzeigt, dass die UVA-Modellierung erfolgreich war; im Vergleich zur Negativkontrolle NC (UVA-Bestrahlung) waren die MMP-1-Expressionsniveaus der beiden Probengruppen signifikant herunterreguliert (P < 0,05), es hat eine hemmende Wirkung auf die Expression des MMP-1-Gens; der MMP-1-Gehalt der beiden Probengruppen war signifikant herunterreguliert (P < 0,01), und der MMP-1-Gehalt der Propolis-Ethanol-Lösungsbehandlungsgruppe war niedriger als der der nicht bestrahlten BC-Gruppe. Die obigen Ergebnisse zeigen, dass sowohl Propolis-Ethanol- als auch Propolis-Polyethylenglykol-Proben die Synthese von MMP-1 bei einer Konzentration von 0,08 % hemmen können, so dass die beiden Proben die Expression von MMP-1 hemmen können, um die Hemmung der extrazellulären Matrix zu fördern, um dies zu erreichen ECM-Abbau, um einen gewissen Anti-Photoaging-Effekt auszuspielen.

3 Diskussion

Verglichen mit der Negativkontroll-NC(UVA+)-Gruppe wurden sowohl Propolis-Ethanol-Lösung als auch Propolis-Polyethylenglykol-Lösung in einer Konzentration von 0,08 % verabreicht, hat eine hochsignifikante herunterregulierende Wirkung auf den ROS-Grad; und kann die Expression des oxidationsbezogenen MMP-1-Gens in menschlichen Fibroblasten signifikant verringern; es hat eine hochsignifikante herunterregulierende Wirkung auf den MMP-1-Gehalt. Die Ergebnisse zeigen, dass Propolis-Ethanol-Lösung und Propolis-Polyethylenglykol-Lösung einerseits die durch freie Radikale induzierte Hautalterung verhindern, indem sie aktiven Sauerstoff ROS abfangen; Verglichen mit 75 % Polyethylenglykol als Lösungsmittel hat das Auflösen von Propolis mit 75 % Ethanol als Lösungsmittel eine höhere ROS-Inhibitionsrate und eine geringere Expression des oxidationsbezogenen Gens MMP-1 mRNA. Der MMP-1-Gehalt ist geringer; Daraus lässt sich ableiten, dass Propolis-Ethanol-Lösung eine höhere Anti-Photoaging-Aktivität aufweistals Propolis-Polyethylenglykol-Lösung.

Aktuell ist die Vorbeugung und Verzögerung der Hautalterung zu einem der Forschungsschwerpunkte in den Bereichen Medizin, Kosmetik und Biomaterialien geworden. Die Hautalterung kann unterteilt werden in endogene Alterung durch innere Faktoren und exogene Alterung sekundär durch äußere Faktoren, von denen UV-Strahlung der wichtigste Faktor ist [21]. Die Entwicklung von sicheren und wirksamen Anti-Aging-Produkten ist eine wichtige Richtung der damit verbundenen industriellen Forschung. Diese Studie soll neue Ideen für die Entwicklung von Hautalterungsprodukten für die pharmazeutische und kosmetische Industrie liefern und die Weiterentwicklung der Bienenproduktindustrie vorantreiben. Allerdings weist die aktuelle Forschung noch einige Mängel auf. Erstens gibt es nur wenige Studien über die Anti-Photoaging-Wirkstoffe von Propolis, wie Flavonoide, PhenoSäuren und Terpene. Zweitens sind in diesem Stadium Apoptose-bezogene Gene und alterungsbezogene Indikatoren wie Zellzyklus, Mitochondia-Fusionsprotein und oxidativer Stress-bezogene Genexpression noch unzureichend. Der Schutzmechanismus von Propolis auf den Körper ist komplex und spielt eine koordinierende Rolle für den gesamten Körper, anstatt nur einen bestimmten Stoff oder Signalweg zu hemmen oder zu fördern. viel eingehende Recherche.



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